技術服務

01 技術原理

DNBelab C4技術是(shì)基于(yú)負壓的(de)液滴微流控系統，通過引入自主專利的(de)液滴标簽技術（Disc-seq:Droplet-indexed high-throughput single-cell sequencing），将帶有标簽的(de)捕獲磁珠與單個(gè)細胞或者細胞核包裹在(zài)液滴中，采用Droplet index的(de)技術實現磁珠的(de)超泊松分布，在(zài)液滴中完成細胞裂解和(hé / huò)捕獲mRNA或DNA分子(zǐ)及用于(yú)識别來(lái)自同一(yī / yì ／yí)液滴磁珠的(de)标簽序列，對cDNA和(hé / huò)Droplet index進行文庫構建和(hé / huò)測序，即可一(yī / yì ／yí)次性獲得大(dà)量細胞的(de)基因表達或染色質開放區基因信息。此技術與常規液滴單細胞測序技術如Drop-seq平台1%-3%的(de)細胞回收率相比，回收率提高至30%-60%，顯著提高了(le／liǎo)細胞的(de)利用率，降低了(le／liǎo)單次細胞投入量。

02 技術流程

單細胞測序的(de)一(yī / yì ／yí)般流程包括細胞懸液制備、單細胞分離、裂解、擴增、建庫、測序、數據分析等步驟。

scRNA-seq

該技術基于(yú)便攜的(de)負壓裝置将帶有标簽的(de)mRNA捕獲磁珠與單個(gè)細胞或者細胞核包裹在(zài)液滴中，采用Droplet index的(de)技術實現磁珠的(de)超泊松分布，在(zài)液滴中完成細胞裂解和(hé / huò)捕獲mRNA分子(zǐ)及用于(yú)識别來(lái)自同一(yī / yì ／yí)液滴磁珠的(de)标簽序列，對cDNA和(hé / huò)Droplet index進行文庫構建和(hé / huò)測序，即可一(yī / yì ／yí)次性獲得大(dà)量細胞的(de)基因表達信息。

圖1 基于(yú)自主标簽技術（Disc-seq）的(de)單細胞轉錄組測序技術 scRNA-seq 

scATAC-seq

單細胞ATAC-seq從組織或細胞富集細胞核，然後利用Tn5轉座酶對染色質開放區進行切割，通過DNBelab C4單細胞設備，包裹轉座後的(de)細胞核和(hé / huò)帶有标簽的(de)磁珠，在(zài)液滴内完成染色質開放區的(de)富集和(hé / huò)擴增，後續可根據高通量測序流程制備文庫并進行測序及生信分析，轉座後細胞核投入芯片5,000-15,000，獲取1,500-9,000細胞，雙包率 <5%。

03 建庫流程

scRNA-seq

1）逆轉錄：将生成的(de)液滴經過破乳後，構建逆轉錄反應體系完成 RNA 反轉錄。

2）二鏈合成：将反轉錄産物利用二鏈合成反應體系進行二鏈合成。

3）PCR擴增：對合成的(de)cDNA按照設置PCR反應體系及參數進行PCR擴增。

4）cDNA及oligo産物純化：将PCR産物使用Cleanup Beads A完成純化，分别純化出(chū)cDNA和(hé / huò)oligo産物。

5）文庫質量檢測：取1μl cDNA及oligo産物使Qubit dsDNA HS Kit檢測濃度，使用Agilen DNA分析試劑盒檢測片段分布。

6）上(shàng)機測序：文庫檢測合格，上(shàng)機測序。

scATAC-seq

1）酶處理：将生成的(de)液滴經過破乳後，利用ATAC Enzyme II的(de)反應體系進行酶處理，去除冗餘片段。

2）PCR擴增：對回收的(de)DNA按照設置PCR反應體系及參數進行PCR擴增。

3）PCR擴增産物純化：将PCR産物使用Cleanup Beads A完成純化。

4）文庫質量檢測：取DNA産物使Qubit dsDNA HS Kit檢測濃度，使用2100 High Sensitivity Chip檢測片段分布。

5）上(shàng)機測序：文庫檢測合格，上(shàng)機測序。

04 測序策略

使用華大(dà)自主研發的(de)國(guó)産化DNBSEQ Tx系列超高通量的(de)測序儀進行測序。

scRNA-seq

測序讀長：30+100+10bp 測序數據量：500M reads

圖2 scRNA 測序策略示意圖 

scATAC-seq

測序讀長 20+50+50bp 測序數據量：500M reads

圖3 scATAC測序策略示意圖

05 信息分析

圖4 食蟹猴組織/器官水平的(de)單細胞UMAP聚類結果(左)以(yǐ)及通過質控的(de)每種組織中的(de)細胞數量(右)

圖5 食蟹猴所有 cluster 的(de)細胞類型注釋(左)以(yǐ)及通過質控的(de)每種細胞類型的(de)細胞數量(右)

圖6 C4 scATAC-seq分析流程圖

C4 scATAC-seq 部分結果展示：

圖7A大(dà)鼠大(dà)腦皮層樣本scATAC-seq數據的(de)UMAP聚類圖（共計29,023個(gè)單細胞核數據）；

圖7B不(bù)同細胞類型中marker基因及管家基因的(de)染色質開放區域圖（如Tmem119基因的(de)TSS區域僅在(zài)microglia中檢測到(dào)，而(ér)在(zài)其他(tā)細胞類型中沒有）